Pembuatan Preparat Apus Darah

Pembersihan Slide

Gelas obyek yang kotor harus dibersihkan dengan merendamnya dalam deterjen pada 60 ° C selama 15 sampai 20 menit, kemudian membilasnya dengan air panas sebelum dikeringkan. Gelas obyek yang  baru   perlu dibersihkan  dengan merendamnya dalam larutan pembersih kalium dikromat (20 g K₂Cr₂O₇ dalam 100 mL air dengan 900 ml H₂SO₄ pekat) selama 48 jam. Setelah itu dibilas dalam air mengalir. Gelas obyek harus disimpan dalam metanol 95% dan  menyeka bersih serta dikeringkan sebelum digunakan.

Metodologi Persiapan Film Darah

Metodologi persiapan darah apus yang khas adalah: Metode Wedge ("Dorong"), Metode Coverglass ("Tarik"), Film Darah berputar(“Spun Blood Film”) direkomendasikan pengenceran darah dengan garam isotonik.

Jenis Sampel Darah

Dua jenis sampel darah vena (antikoagulan) dan kapiler, yang diperoleh dengan menusuk kulit (tanpa antikoagulan), seperti K₂EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid) atau K₃EDTA, sodium citrate, dan acid citrate-dextrose (ACD).  

Efek penyimpanan sampel

Sampel darah harus diproses secepat mungkin setelah dikoleksi. Atau bisa disimpan pada temperatur 4⁰C selama kurang dari 8 (delapan)  jam dan harus diaduk minimal 10 kali sampai tercampur merata.

Tabung kapiler

Tabung kapiler plastik (polystyrene atau gelas)  yang direkomendasikan untuk menempatkan darah   ke gelas obyek.

Volume darah

Volume darah yang digunakan harus memungkinkan untuk mendapatkan film darah pada ketebalan yang tepat dan panjangnya 2,5 (dua setengah)  sampai 4(empat) cm.

Posisi Tetesan Darah

Posisi tetesan darah harus sekitar 1 (satu) cm dari akhir gelas obyek atau jarak 1(satu) cm dari label.

Penyebar
Idealnya, penyebar harus sedikit lebih sempit dari kaca geser. Dalam prakteknya, gelas obyek  kedua sering digunakan sebagai penyebar, dan prosedur ini dapat diterima/dilakukan.

Pemerataan darah dengan gelas penyebar

Begitu setetes darah telah ditempatkan pada gelas obyek, gelas penyebar harus bergerak mundur perlahan pada sudut sekitar 30° sampai 45° ke arah tetesan darah. Tetesan darah harus menyebar cepat di sepanjang tepi gelas penyebar itu. Setelah darah tersebar di sepanjang  tepi, gelas penyebar harus segera bergerak maju pada tingkat yang stabil, pada kecepatan cukup cepat, dan pada sudut 45° sampai semua darah telah menyebar ke gelas obyek.

Kecepatan Penyebaran

Semakin cepat darah tersebar pada gelas obyek, tebal film yang diharapkan akan didapatkan. Pelatihan dan pengalaman diperlukan untuk mendapatkan hasil yang konsisten.

Ketebalan Film Darah

Ketebalan dari film darah dipengaruhi oleh ukuran tetesan darah, tingkat hemoglobin pasien, sudut
penyebaran (semakin besar sudut, darah semakin tebal dan film pendek), dan kecepatan penyebaran.

Pengeringan Film Darah

Biasanya,  pengeringan dilakukan dengan mengeringanginkan sudah cukup. Dalam kondisi lembab, dianjurkan pengeringan dengan menggunakan dry cooller.

Pewarnaan Mei-Grünwald-Giemsa

Reagen
(1) Metanol absolute. (2) Cairan pewarna I : 0,3 g bubuk Mei-Grünwald dalam 100 ml metanol absolut; letakkan dalam wadah pada suhu kamar selama 24 jam. Ini harus disaring sebelum digunakan. Cairan pewarna  II (Giemsa stain): 1 g bubuk pewarna Giemsa dilarutkan dalam 66 ml gliserol dan dipanaskan sampai 56 ° C selama 90 - 120 menit. Setelah penambahan 66 mL metanol absolut dan tercampur sempurna, larutannya dibiarkan pada suhu kamar dalam wadah tertutup. Ini harus disaring sebelum digunakan. (3) Buffer: Sorensen yang solusi penyangga. PH harus 6,8 untuk Mei-Grünwald-Giemsa stain bukan 6,4 seperti dalam pewarnaanWright.

Metode

Langkah 1: Fiksasi  selama minimal 30 detik dalam metanol absolut.

Langkah 2: Hapus metanol dengan memiringkan gelas obyek atau hanya dengan memindahkan dari jar fiksasi.

Langkah 3: Beri larutan pewarnaan I , yang diencerkan dengan buffer (v/v) selama 5 menit pada gelas obyek yang diposisikan horizontal   atau dalam staining jar.

Langkah 4: Pindahkan gelas obyek dari jar tanpa mencuci (atau menghapus larutan pewarna dengan menahan gelas obyek vertikal) ke dalam larutan pewarnaan II yang telah diencerkan dengan 9 (sembilan) bagian larutan penyangga (buffer) selama 10 -15 menit.

Langkah 5: Pindahkan gelas obyek ke jar dengan buffer untuk 1 (satu) kali  bilas setelah menghapus pewarnaan.

Langkah 6: Cuci gelas obyek dengan air yang cukup.

Langkah 7: Transfer gelas obyek ke jar berisi air selama 2 (dua) sampai 5 (lima) menit.

Langkah 8: Keringkan gelas obyek pada posisi miring, jangan sampai pewarna kering.

Langkah 9: Tutup dengan gelas penutup (coverglass) jika diinginkan.

Komentar

Hal penting yang perlu diperhatikan dalam metode ini adalah gelas obyek tidak diperbolehkan sampai kering atau menguap pada setiap langkah-langkah untuk mencegah artefak pewarnaan dan pembentukan endapan.