Analisis Ekspresi Gen Penyandi Transporter Besi (OsIRT1) Padi (Oryza sativa L.) terhadap Cekaman Besi

Hi, postingan yang satu ini sebenarnya merupakan kelanjutan dari postingan sebelumnya yang berjudul "Respon Morfologi Tanaman Padi (Oryza sativa L.) terhadap Cekaman Besi". Namun, pada postingan ini difokuskan pada kajian molekulernya saja. yep, langsung saja ya saya bersenandung.

Ringkasnya adalah sebagai berikut, sebelum sampai kepada tahap analisis ekspresi gen, tentunya saya harus melakukan isolasi RNA, kemudian sintesis cDNA, baru setelah itu ujung dari cerita ini akan terlihat melalui amplifikasi primer spesifik untuk mengetahui tingkat ekspresi suatu gen. Disini analisis ekspresi gen saya lakukan secara semikuantitatif yakni hanya mengamati profil pita hasil amplifikasi primer spesifik melalui PCR. Sebenarnya, analisis ekspresi suatu gen juga dapat dilakukan secara kuantitatif yakni melalui qRT-PCR. Oke langsung saja saya sampaikan hasil small project saya ini.

Tahapan isolasi RNA total terdiri atas 3 tahap utama, yaitu pemecahan dinding sel, ekstraksi dan permurnian RNA. Pemecahan dinding sel berfungsi  untuk membebaskan komponen sitoplasma dan RNA dalam sel. Tahap kedua, yaitu ekstraksi yang meliputi penggunaan senyawa pengekstrak dan pengendapan  RNA. Pada praktikum ini ekstraksi RNA menggunakan AccuZol^TM total RNA Extraction Kit dengan mengikuti instruksi pabrik (USA Bioneer, Inc.). Reagen AccuZol  merupakan larutan yang sudah dilengkapi dengan fenol dan garam guanidin yang mampu menghambat aktivitas RNase dan mampu menjaga integritas RNA selama  proses lisis dan homogenasi sampel (USA Bioneer, Inc.). Penggunaan kloroform yang dilanjutkan dengan sentrifugasi pada tahapan isolasi RNA berfungsi untuk memisahkan aqueous phase (fase atas) dan fase organik (fase bawah). RNA berada pada fase atas. Penggunaan isopropanol berfungsi untuk presipitasi RNA, sedangkan etanol berfungsi untuk mencuci RNA dari kontaminan (USA Bioneer, Inc.). Isolasi RNA total yang dilakukan pada praktikum ini berasal dari dua macam jaringan yaitu daun dan akar padi dari perlakuan cekaman besi 400 ppm selama 4 hari. Pengambilan sampel untuk isolasi RNA dilakukan dengan hati-hati. Sampel yang berhasil diambil selanjutnya disimpan dalam ice-box berisi es untuk menjaga agar sel tidak rusak.

Analisis kualitatif RNA total diamati menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 % di dalam buffer MOPS 1 % (v/v) yang kemudian divisualisasikan dengan menggunakan UV Transiluminator. Hasil elektroforegram menunjukkan bahwa RNA total berhasil diisolasi pada akar dan padi. Namun isolasi tidak berhasil dilakukan pada semua sampel (Gambar 1). RNA berhasil diisolasi kecuali pada sampel A1P dan D2P. Beberapa hal yang dapat mungkin menyebabkan tidak berhasilnya RNA diisolasi yaitu karena proses homogenasi dan lisis sampel yang tidak sempurna.

Gambar 1. Hasil elektroforegram RNA total akar dan daun padi

Hasil elektroforegram terhadap RNA total akar dan daun padi menunjukkan adanya perbedaan intensitas pita. Perbedaan intensitas pita ini dapat mengindikasikan konsentrasi RNA yang beragam pada masing-masing sampel,  hal  ini perlu diperhatikan karena akan mempengaruhi hasil analisis ekspresi gen. Penggunaan konsentrasi RNA pada uji ekspresi dengan metode RT-PCR memerlukan konsentrasi  RNA  yang  sama karena akan mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk. Hasil elektroforegram RNA total menunjukkan adanya 2 pita  RNA yang dominan pada RNA total yang diisolasi dari akar maupun daun padi baik perlakuan kontrol maupun dengan cekaman besi 400 ppm. Kedua pita dominan tersebut merupakan pita yang menunjukkan RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S (Gambar 1). Hal ini menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi sehingga sangat baik digunakan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total. Selain itu juga menunjukkan bahwa RNA yang diisolasi tidak mengalami degradasi.

Jumlah sampel yang digunakan pada uji kuantitatif ini hanya 6 sampel. Hal ini dikarenakan berdasarkan hasil elektroforesis (Gambar 1) menunjukkan terdapat 2 sampel yang tidak menghasilkan pita. Tidak munculnya pita tersebut diasumsikan bahwa RNA tidak berhasil diisolasi sehingga tidak dilakukan uji kuantitatif. Uji kuantitatif dilakukan dengan Thermo Scientific Nanodrop 2000 Spectrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Uji kuantitatif ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan tingkat kemurnian RNA total yang berhasil diisolasi. Konsentrasi RNA hasil isolasi berdasarkan pengukuran pada panjang gelombang 260 nm, nilai 1 unit absorban sebanding dengan 1 μg/ml RNA (Wilson dan Walker 2000). Berdasarkan Sambrook et al. (1989) konsentrasi RNA didapat dari perkalian nilai absorban dengan faktor pengenceran dan 40 μg/ml. Konsentrasi RNA total pada semua sampel berkisar antara  886.90-3297.85  ng/μl. Hasil pengukuran tingkat kemurnian RNA menggunakan Thermo Scientific Nanodrop 2000 Spectrofotometer menunjukkan bahwa rasio serapan pada panjang gelombang A260/A280 berkisar antara 1.54-1.97.

Perbandingan serapan pada panjang gelombang A260/A280 menunjukkan  kemurnian RNA terhadap adanya kontaminan protein. Perbandingan 1.80-2.00 menunjukkan tingkat kemurnian yang cukup baik dan sedikitnya kontaminan protein dalam larutan ekstrak RNA. Hasil praktikum menunjukkan bahwa hanya sampel D2K yang bebas dari kontaminasi protein. Sampel yang lain menunjukkan tingkat kontaminasi protein yang bervariasi. Kontaminasi protein paling tinggi terdapat pada sampel A1K dengan rasio A260/A280 sebesar 1.54.

Praktikum ini menggunakan kit  iScript cDNA synthesis (BIO-RAD). Reaksi dimulai dengan penambahan primer oligo(dT), primer ini akan berpasangan dengan adenin pada mRNA (ekor poli A). Komponen nukleotida (dNTP) dengan bantuan  enzim reverse transcriptase akan berpasangan dengan basa komplemennya pada mRNA sehingga terbentuk utas pertama cDNA. Proses selanjutnya yaitu mRNA dipisahkan dari hibrid (mRNA-cDNA) dengan cara mendegradasi mRNA menggunakan enzim RNaseH.

Sebelum cDNA digunakan dalam PCR maka terlebih dahulu dilakukan pengukuran konsentrasinya. Pada praktikum ini hanya digunakan 2 macam sampel yang digunakan untuk sintesis cDNA total karena laboratorium hanya menyediakan untuk 2 sampel saja atas pertimbangan harga enzim yang mahal. Dua sampel yang digunakan pada tahapan ini dipilih hasil isolasi RNA dari padi dengan sifat toleran terhadap besi yaitu perlakuan kontrol dan cekaman besi 400 ppm. Penggunaan konsentrasi cDNA pada analisis ekspresi dengan metode RT-PCR memerlukan konsentrasi cDNA yang sama karena akan mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk. Sebanyak 500 ng/μl cDNA diamplifikasi menggunakan PCR. Teknik ini digunakan untuk mendeteksi  gen OsIRT1 pada akar padi menggunakan  primer  spesifik yang telah didesain sebelumnya. Primer Actin digunakan sebagai kontrol.

Hasil praktikum menunjukkan bahwa konsentrasi cDNA hasil sintesis yaitu berkisar antara 1597.3-1615 ng/μl dengan tingkat kemurnian yang cukup baik yakni 1.74-1.78. Berdasarkan hasil sintesis cDNA tersebut sehingga konsentrasi cetakan yang akan digunakan untuk analisis ekspresi melalui PCR dengan primer spesifik berikutnya dapat ditentukan.

Analisis ekpresi pada penelitian ini dilakukan menggunakan teknik RT-PCR. Sampel yang diuji merupakan sampel akar padi varietas Pokkali yang mendapat perlakuan cekaman besi 400 ppm dibandingkan dengan kontrol. Molekul cDNA hasil sintesis selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa 1 %. Tingkat ekspresi gen diamati melalui perbedaan intensitas pita yang dihasilkan oleh masing-masing sampel. Intensitas pita yang muncul berbanding lurus dengan tingkat ekspresi gen. Hasil praktikum menunjukkan bahwa adanya perlakuan cekaman besi 400 ppm selama 4 hari menyebabkan peningkatan ekspresi gen OsIRT1 pada akar padi varietas Pokkali (Gambar 2). Peningkatan ekspresi gen OsIRT1 tersebut dapat diamati dari intensitas pita hasil elektroforegram yang lebih tebal dibandingkan dengan kontrol. Ukuran pita untuk gen OsIRT1 pada praktikum ini yaitu 168 bp, sedangkan ukuran pita untuk gen Actin yaitu 136 bp.

Gambar 2. Elektroforegram hasil RT-PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk gen Actin (kontrol) dan gen OsIRT1