Pembersihan Slide
Gelas
obyek yang kotor harus dibersihkan dengan merendamnya dalam deterjen pada 60 °
C selama 15 sampai 20 menit, kemudian membilasnya dengan air panas sebelum
dikeringkan. Gelas obyek yang baru perlu dibersihkan dengan
merendamnya dalam larutan pembersih kalium dikromat (20 g K2Cr2O7
dalam 100 mL air dengan 900 ml H2SO4 pekat) selama
48 jam. Setelah itu dibilas dalam air mengalir. Gelas obyek harus disimpan
dalam metanol 95% dan menyeka bersih serta dikeringkan sebelum digunakan.
Metodologi Persiapan Film Darah
Metodologi
persiapan darah apus yang khas adalah: Metode Wedge
("Dorong"), Metode Coverglass ("Tarik"), Film
Darah berputar(“Spun Blood Film”) direkomendasikan pengenceran darah dengan
garam isotonik.
Jenis Sampel Darah
Dua jenis
sampel darah vena (antikoagulan) dan kapiler, yang diperoleh dengan menusuk
kulit (tanpa antikoagulan), seperti K2EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid)
atau K3EDTA, sodium citrate, dan acid citrate-dextrose (ACD).
Efek penyimpanan sampel
Sampel darah
harus diproses secepat mungkin setelah dikoleksi. Atau bisa disimpan pada
temperatur 40C selama kurang dari 8 (delapan) jam dan harus
diaduk minimal 10 kali sampai tercampur merata.
Tabung kapiler
Tabung
kapiler plastik (polystyrene atau gelas) yang direkomendasikan untuk
menempatkan darah ke gelas obyek.
Volume darah
Volume darah
yang digunakan harus memungkinkan untuk mendapatkan film darah pada ketebalan
yang tepat dan panjangnya 2,5 (dua setengah) sampai 4(empat) cm.
Posisi Tetesan Darah
Posisi
tetesan darah harus sekitar 1 (satu) cm dari akhir gelas obyek atau jarak
1(satu) cm dari label.
Penyebar
Idealnya, penyebar harus sedikit lebih sempit dari kaca geser. Dalam prakteknya, gelas obyek kedua sering digunakan sebagai penyebar, dan prosedur ini dapat diterima/dilakukan.
Idealnya, penyebar harus sedikit lebih sempit dari kaca geser. Dalam prakteknya, gelas obyek kedua sering digunakan sebagai penyebar, dan prosedur ini dapat diterima/dilakukan.
Pemerataan darah dengan gelas penyebar
Begitu
setetes darah telah ditempatkan pada gelas obyek, gelas penyebar harus bergerak
mundur perlahan pada sudut sekitar 30° sampai 45° ke arah tetesan darah.
Tetesan darah harus menyebar cepat di sepanjang tepi gelas penyebar itu.
Setelah darah tersebar di sepanjang tepi, gelas penyebar harus segera
bergerak maju pada tingkat yang stabil, pada kecepatan cukup cepat, dan pada
sudut 45° sampai semua darah telah menyebar ke gelas obyek.
Kecepatan Penyebaran
Semakin
cepat darah tersebar pada gelas obyek, tebal film yang diharapkan akan
didapatkan. Pelatihan dan pengalaman diperlukan untuk mendapatkan hasil yang
konsisten.
Ketebalan Film Darah
Ketebalan
dari film darah dipengaruhi oleh ukuran tetesan darah, tingkat hemoglobin
pasien, sudut
penyebaran (semakin besar sudut, darah semakin tebal dan film pendek), dan kecepatan penyebaran.
penyebaran (semakin besar sudut, darah semakin tebal dan film pendek), dan kecepatan penyebaran.
Pengeringan Film Darah
Biasanya,
pengeringan dilakukan dengan mengeringanginkan sudah cukup. Dalam kondisi
lembab, dianjurkan pengeringan dengan menggunakan dry cooller.
Pewarnaan Mei-Grünwald-Giemsa
Reagen
(1) Metanol absolute. (2) Cairan pewarna I : 0,3 g bubuk Mei-Grünwald dalam 100 ml metanol absolut; letakkan dalam wadah pada suhu kamar selama 24 jam. Ini harus disaring sebelum digunakan. Cairan pewarna II (Giemsa stain): 1 g bubuk pewarna Giemsa dilarutkan dalam 66 ml gliserol dan dipanaskan sampai 56 ° C selama 90 - 120 menit. Setelah penambahan 66 mL metanol absolut dan tercampur sempurna, larutannya dibiarkan pada suhu kamar dalam wadah tertutup. Ini harus disaring sebelum digunakan. (3) Buffer: Sorensen yang solusi penyangga. PH harus 6,8 untuk Mei-Grünwald-Giemsa stain bukan 6,4 seperti dalam pewarnaanWright.
(1) Metanol absolute. (2) Cairan pewarna I : 0,3 g bubuk Mei-Grünwald dalam 100 ml metanol absolut; letakkan dalam wadah pada suhu kamar selama 24 jam. Ini harus disaring sebelum digunakan. Cairan pewarna II (Giemsa stain): 1 g bubuk pewarna Giemsa dilarutkan dalam 66 ml gliserol dan dipanaskan sampai 56 ° C selama 90 - 120 menit. Setelah penambahan 66 mL metanol absolut dan tercampur sempurna, larutannya dibiarkan pada suhu kamar dalam wadah tertutup. Ini harus disaring sebelum digunakan. (3) Buffer: Sorensen yang solusi penyangga. PH harus 6,8 untuk Mei-Grünwald-Giemsa stain bukan 6,4 seperti dalam pewarnaanWright.
Metode
Langkah
1: Fiksasi selama minimal 30 detik dalam metanol absolut.
Langkah 2: Hapus metanol dengan memiringkan gelas obyek atau hanya dengan memindahkan
dari jar fiksasi.
Langkah
3: Beri larutan pewarnaan I , yang diencerkan dengan buffer (v/v) selama 5
menit pada gelas obyek yang diposisikan horizontal atau dalam staining
jar.
Langkah
4: Pindahkan gelas obyek dari jar tanpa mencuci (atau menghapus larutan pewarna
dengan menahan gelas obyek vertikal) ke dalam larutan pewarnaan II yang telah
diencerkan dengan 9 (sembilan) bagian larutan penyangga (buffer) selama 10 -15 menit.
Langkah
5: Pindahkan gelas obyek ke jar dengan buffer untuk 1 (satu) kali
bilas setelah menghapus pewarnaan.
Langkah
6: Cuci gelas obyek dengan air yang cukup.
Langkah
7: Transfer gelas obyek ke jar berisi air selama 2 (dua) sampai 5 (lima) menit.
Langkah
8: Keringkan gelas obyek pada posisi miring, jangan sampai pewarna kering.
Langkah
9: Tutup dengan gelas penutup (coverglass) jika diinginkan.
Komentar
Hal
penting yang perlu diperhatikan dalam metode ini adalah gelas obyek tidak
diperbolehkan sampai kering atau menguap pada setiap langkah-langkah untuk
mencegah artefak pewarnaan dan pembentukan endapan.